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「干货集市」转录组建库实验中的那些事儿

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浏览:- 发布日期:2017-12-08 15:32:51【

转录组测序是指特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和,包括mRNA和非编码RNA。转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点,通过新一代高通量测序,能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息,已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。

转录组测序前非常重要的一步是文库构建,构建的文库质量直接影响转录组测序的结果以及后续的生物信息学分析。根据研究对象的不同,需要选择相应的建库策略:

澳门永利开户注册 - 如果研究mRNA,可以利用真核生物mRNA的poly-A结构,通过oligoT将其分离、纯化后建库;

- 如果研究lncRNA、全转录组澳门永利开户注册或原核生物转录组,可以通过去除rRNA的方式进行建库。

本文以mRNA转录组测序为例,介绍一下转录组建库实验中的一些注意事项和小技巧。

转录组建库实验流程图

首先是实验前的准备工作,要将磁珠从4 oC取出,回复至室温后才能使用,否则会影响磁珠与RNA或DNA的结合效率。实验中用到的试剂都要提前30min从冰箱中拿出解冻、回复室温后使用,但所有的酶类要现拿现用,用完立即放回至-20 oC贮存。

由于不同样品的total RNA中mRNA的含量差异较大,若total RNA起始投入量过低,不能确保得到足够的mRNA用于后续文库构建,因此建议RNA的起始量为1-4μg。不完整或降解的总RNA模板会给测序澳门永利开户注册结果带来3’偏好性,建议使用RIN值≥7的RNA模板进行建库。

利用Oligo dT磁珠对mRNA进行富集和纯化时,在移除上清时要等磁珠被彻底吸附后(上清澄清)在磁力架上小心进行,避免吸到磁珠,以免造成mRNA的损失。加入片段化试剂前,要将Bead Washing Buffer吸干净,否则会影响片段化结果,可以在用排枪移除液体之后再用10μl的移液枪移除残留的Washing Buffer。

mRNA片段化时,要根据需要的文库片段大小选择合适的打断温度和时间,若片段化条件与最初设置不符,后续分选步骤必须选择与此处打断条件对应的操作,否则将建库失败,最终的文库大小也会改变。片段化后应立即进行一链cDNA合成,因为mRNA在该体系下容易降解。

在dA-Tailing、接头连接时若不小心加错了试剂,由于此时是DNA样品,可加1.8 × DNA Clean Beads进行纯化后,继续下一步实验。

在片段大小分选时,要根据磁珠体积比严格控制加样体积,分选中任何一步加样体积偏差都将影响最终文库插入片段大小。此外,第一轮分选后是需要吸取上清至新的U型板中,切勿丢弃上清,转移上清时不要吸到磁珠,否则大片段DNA进入下一步,导致最终文库有大片段残留。

实验中所有的磁珠纯化实验,80%的乙醇要现配现用,加入80%乙醇时不要吹散磁珠,第二遍80%乙醇漂洗磁珠后,应尽量吸干上清,减少杂质残留,可使用10 μl移液器将残留液体吸干净;在洗脱前应保证磁珠充分干燥(表面由光亮褐色变为磨砂褐色),避免乙醇残留影响后续实验,但过分干燥(龟裂)将导致DNA样品损失。洗脱后转移上清时也要避免吸到磁珠,否则会影响文库产量。

实验过程中如需暂停,需按照试剂盒说明书中注明的可停放点将样品放置于合适的温度下保存,不正确的停放可能会降低建库成功率。如二链cDNA产物、接头连接反应终止后产物均可在4 oC暂存1h;但片段化和末端修复之后要立即进行下一步反应,否则会影响文库质量。

文库构建完成后要用Qubit定量文库的浓度,并用Agilent 2100 Bioanalyzer 评价文库质量,良好的文库应在预计大小的位置有一个较窄的峰,而其他位置无峰。如果在128 bp左右出现峰,则提示文库中有adapter-dimer污染。此时,可将文库用Nuclease-free H2O 稀释至50 μl后用磁珠纯化。

质检合格的文库就可以在illumina平台进行上级测序啦!

以上就是关于真核生物mRNA转录组建库中的一些注意事项和小技巧,欢迎在留言区发表你的看法或观点哦。

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