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功能基因筛选干货系列——作物改良(一)

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浏览:- 发布日期:2016-11-16 14:18:33【

引言

最近有关作物野生种的研究逐渐受到重视,相关研究持续升温。上海植生所黄学辉研究员同所长韩斌院士曾合著了一篇文章对作物野生种的相关研究现状进行了综述,小编就借这篇文章为大家总结一下作物野生种研究近年来的进展。

INTRODUCTION

功能基因筛选干货系列——作物改良(一)

Variation of berry size in tomatillos

野生种自发突变(spontaneous mutations)是导致作物自然变异的主要原因。自大约一万年前人类开始进行农耕起,作物为了适应不同环境的栽种已经演变出了许多不同的品种。作物驯化和育种对当今作物的遗传多样性具有非常深远的影响。加深对各种表型和驯化过程的理解有助于我们更加有效地利用这些遗传多样性资源来进行作物改良。

全球数十亿人对食物的需求十分巨大,这就对通过育种手段提高作物产量提出了很大挑战。对作物中自然产生的等位基因的利用极大地提高了粮食产量。利用庞大的种质资源和各种遗传学工具(例如基因组序列、遗传群体、单倍型数据集、GWAS、转基因技术等),研究作物的学者们现在可以基于序列多态性快速地研究、开发众多自然多态性及其相关表型多态性。近期NGS的发展促进了作物设计和基因组筛选中自然变异的发现和利用。

ADVANCES IN CROP GENOME SEQUENCING

参考基因组序列是作物遗传学研究的基础,也是快速进行作物自然多态性遗传学研究的重要资源。自从十几年前水稻基因组测序完成,其他几种主要作物的参考序列——包括大麦,小米,玉米,高粱,马铃薯,番茄和甘蓝型油菜——也已完成。参考序列可由以下策略测定:clone-by-clone(例如细菌人工染色体,水稻和玉米利用该方法完成)、whole-genome shotgun(例如高粱和小米)或者一些综合性的方法(例如马铃薯和大麦)。Clone-by-clone能够提供高质量的基因组组装结果。由于无参whole-genome shotgun测序数据的组装常有大量sequence gaps,特别是使用二代测序技术时会非常需要附加其他信息以构建long superscaffolds,所以高质量的组装显得尤为重要。二代测序所需的补充信息可能包括long-insert paired-endreads的整合、从细菌人工染色体测序(或者指纹图谱)得到的的物理图谱、高密度遗传图谱等。参考序列的质量对相关研究影响巨大,是由测序策略和测序用的作物基因组共同决定的:不同作物物种在基因组大小、重复序列比例以及染色体倍数上有很大差异。一些巨大且复杂的作物基因组例如面包小麦的高质量组装仍是很大的挑战。

作物参考基因组放出后,通过二代测序技术和新的计算方法推动了大量不同基因组的重测序,是遗传定位和进化研究的重要参考。高通量测序技术快速拓展了我们在作物遗传多样性方面的知识。对六个玉米骨干自交系进行的测序鉴定了超过一百二十万个SNP和超过三万个indel,且发现数百存在或不存在变化的完整表达基因。在众多不同的序列变化类型中,SNP是最丰富的(在数量上大于所有其他多态性)也是最容易用技术手段鉴定的(Figure 1)。这也是为什么SNP标记广泛应用于大多数高通量基因分型研究中。在二代测序中,小的indel(通常小于6 base pairs)经常在直接拼接时发现;大的结构变异一般于深度测序时发现,常伴随相对较高的假阳性。为了在一个作物中捕捉其完整的序列变化,最好对存在变化的品种都进行深度测序,然后进行基因组组装和比较基因组分析。

功能基因筛选干货系列——作物改良(一)

Figure1 Genomic variation in a natural population, using real data from foxtailmillet

HIGH-THROUGHPUT GENOTYPING

对作物栽培种个体分别进行基因分型可以鉴定其基因组差异。一个个体的基因型包含其世代遗传的信息。通常用多种分子标记展现的等位基因的模式来定义基因型。个体表型是可以观察到的特征,同时受到基因型和环境的影响。传统上通过在一个重组群体中进行连锁定位或者在一个自然群体中进行关联定位来鉴定决定一个表型的基因型。

对应于不同的基因分型方法,存在许多类型的分子标记。基于聚合酶链式反应(PCR)的标记(在琼脂糖凝胶上进行等位基因评分)为近年来的数量性状位点(QTL)定位和基因克隆奠定了基础。然而,当大量个体需要高密度基因分型时,基于PCR标记的基因分型过程是相当费力、昂贵和耗时的。高通量基因分型技术的出现和多种主要作物参考基因组序列的释出大大加速了基因分型的进程。

这里小编对五种高通量基因分型方法做了一个总结(Table 1)。将DNA与在芯片上点样的寡核苷酸杂交来检测SNP的微阵列技术是高通量基因分型的第一次使用。这个技术通常被称为基于微阵列的基因分型方法(microarray-basedgenotyping)能够在短时间内直接扫描基因组上的等位基因变异,覆盖数百到数千个SNP。一旦某物种的综合SNP数据可用,就可以生产设计良好的芯片;一般来说,该技术成本低且工艺相对简单。芯片可以检测约五十至一百万个人类基因组SNP,几乎所有的人类基因组GWAS分析都是用芯片做的。芯片也用于作物的基因分型,例如水稻和玉米。同样会基于杂交芯片的多样性微阵列技术(DArT)定位已经用于很多作物,比如大麦。

功能基因筛选干货系列——作物改良(一)

Table1 Five high-throughput genotyping methods

Abbreviations:eQTL, expression quantitative trait locus; SNP, single-nucleotide polymorphism

二代测序的发展加快了技术的跨越,产生了基于高通量测序的基因分型方法。为了对重组群体进行基因分型,一种利用低覆盖度基因组重测序数据的方法被开发出来。该方法首先应用于重组近交系(RIL)群体(利用Oryzasativa ssp. japonicaNipponbare和Oryzasativa ssp. indica93-11变种杂交构建),高密度基因型定位一共鉴定了14个农艺性状的49个QTL,其中5个主效QTL在基因组上定位于一个很小的区域内,在这里找到了性状决定候选基因。现在这个方法在作物群体定位方面已经扩展出了不同的类型,包括近似等基因系、染色体片段置换系和F2群体。

低深度全基因组重测序方法通过结合不同的算法可以用于自然群体的基因分型,例如依据连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)的以k邻近(k nearest neighbor)为基础的算法,利用该算法可以推断低深度测序造成的缺失,其在水稻和小米中的应用显示出了很高的精确度。现在已经有很多不同特性的数据归集算法,研究者在应用时需要根据实验群体的大小、差异大小、LD衰减率等对测序深度进行调整。一些归集方法——例如基于隐马可夫模型(hidden Markov model)的方法——也适用于远交群体,远交群体通常含有非常多的杂合基因型。对人类群体测序数据的使用和操作显示,经高效归集后,即便是非常低深度的测序也能增强GWAS分析,并且做的比芯片更好。不同作物物种、不同群体大小的测序深度需要用计算模拟来决定。

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Linkage disequilibrium in FTO

对一些基因组很大的作物(例如玉米、大麦和小麦)来说,全基因组重测序仍然很贵。有一些替代方法可以进行全基因组范围的测序。一种是对基因组酶切标签进行测序并鉴定多态性标签。与之类似的一个方法是将切下来的基因组片段连上一个识别接头并建库。通过使用甲基化敏感的限制性酶,可以减少具有转座元件的区域,并且在测序文库中富集具有特定限制酶的相对低拷贝的区域。玉米、高粱和大麦都已使用测序进行基因分型的方法做了相关研究,这些应用说明,尽管得到SNP的数量和分布有限,该方法对于大规模,低成本基因分型仍是非常有效的。

以RNA测序为基础的基因分型方法利用RNA-seq数据获得基因型信息。尽管不同作物的基因组大小有很大差异,其总的基因数量并没有明显差异。因为忽略了大多数重复序列,利用转录本测序推测SNP相比基因组重测序更加高效。最近有研究从368个玉米转录本中获得了大量SNP,同时进行了基因表达数量性状定位(expression QTL, eQTL)。由于玉米基因组中超过80%都是重复序列,若该研究用全基因组重测序进行,其花费将远超目前。

功能基因筛选干货系列——作物改良(一)

Illustration of the concept of cisand trans expression quantitative trait loci (eQTLs)

但是基于RNA-seq的基因分型有几个弱点必须知晓。因为基因中的SNP密度远小于基因间,从RNA-seq得到的SNP数量可能不足以进行GWAS分析,尤其是那些连锁不平衡很高的作物。SNP分布的强烈偏向引起了另一个问题:在一个特定时间点的特定组织中,许多基因只有很低的甚至没有表达量,这导致无法进行基因分型。但是从大型群体多组织、多时间点取样提取RNA将极大增加工作量。得益于外显子捕获,基于外显子测序的基因分型也可以应用于群体大、基因组复杂的作物(Table 1)。

下期小编将为大家介绍作物中的连锁定位和作物驯化基因组多样性,敬请期待。

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